摘要：旨在建立一種準(zhǔn)確且快速的基于瞬時表達(dá)系統(tǒng)的水稻miRNA靶基因驗證系統(tǒng),為研究水稻miRNAs的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。已有研究證實(shí)osa-miR169o剪切靶基因OsNF-YA4(LOC_Os03g48970.1)的mRNA,以此為參照,在煙草和水稻原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)中將miR169o前體基因分別與LUC表達(dá)載體、LUC-48970和LUC-48970m3融合表達(dá)載體瞬時共表達(dá),通過CCD活體成像和Luminometor分析了共表達(dá)后LUC活性的動態(tài)變化。利用莖環(huán)qRT-PCR對miR169o的表達(dá)水平進(jìn)行分析,獲得靶基因驗證的適合體系。在水稻原生質(zhì)體體系中,LUC活性和miR169o表達(dá)水平在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后逐漸增高;24 h時LUC活性最高,相應(yīng)miR169o表達(dá)水平上升10倍左右。綜合分析,在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后24 h-36 h為適宜檢測時間段。在煙草瞬時表達(dá)體系中,農(nóng)桿菌注射72 h后LUC活性最強(qiáng),而miR169o的表達(dá)在48 h后即可上調(diào)20倍。因此,農(nóng)桿菌注射后48 h-72 h為適宜檢測時間段。本系統(tǒng)為水稻miRNA靶基因的驗證提供了一種簡便、快速,且更接近于體內(nèi)真實(shí)情況的實(shí)驗方法。